但不管哪一種方法,首先必須進(jìn)行靶序列的擴增,然后才能進(jìn)行其它檢測。
傳統的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù),如DNA測序、限制性酶切片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異 的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對SNP的檢測,但由于它們必須通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測,因此,距快速、高效、自動(dòng)化的目標還 相差甚遠。
傳統的RFLP只能檢測到SNP的一部分,測序技術(shù)既費時(shí)費力,又不易實(shí)現自動(dòng)化,而且DNA鏈的二級結構還容易造成人工假相,使測序結果出現 偏差,不適宜于SNP的檢測;SSCP則很難滿(mǎn)足自動(dòng)化的需要,難以大規模開(kāi)展工作。因此,這些方法均未被廣泛采用。
DNA芯片技術(shù)是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的一種DNA序列變異檢測工具。DNA芯片(DNA chip),也稱(chēng)生物芯片(biochip),其大小與計算機上的CPU芯片相似,約1 cm2或更大些,以玻璃、硅、聚丙烯等作 為載體基片,芯片上鋪了一層肉眼看不見(jiàn)的DNA纖維“地毯”,即具有特定堿基序列的探針。
待測基因經(jīng)提取后,被切成長(cháng)短不一的片段,經(jīng)熒光化學(xué)物質(zhì)標記 后,注射到嵌有芯片的載片上。
SNP,即單核苷酸多態(tài)性,這種人類(lèi)最常見(jiàn)的可遺傳變異占據了所有已知多態(tài)性的90%以上,因此作為研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應有著(zhù)重要的意義,也因此國際人類(lèi)基因研究學(xué)會(huì )花費大量的資金來(lái)完成人類(lèi)單體型圖譜。
SNP分析從根本上來(lái)說(shuō)其實(shí)就是確定一對染色體的每種基因的兩個(gè)拷貝,哪種點(diǎn)突變在這兩個(gè)拷貝中存在,因此利用定量PCR方法,并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測到SNP結果。ABI號稱(chēng)有數以千記的定量PCR試劑盒,自然在這方面也不會(huì )留下空白,TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百萬(wàn)的HapMap SNPs(人類(lèi)單核苷酸多態(tài)性圖譜SNPs),方便SNP分型高通量研究。
傳統的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù),如DNA測序、限制性酶切片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異 的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對SNP的檢測,但由于它們必須通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測,因此,距快速、高效、自動(dòng)化的目標還 相差甚遠。
傳統的RFLP只能檢測到SNP的一部分,測序技術(shù)既費時(shí)費力,又不易實(shí)現自動(dòng)化,而且DNA鏈的二級結構還容易造成人工假相,使測序結果出現 偏差,不適宜于SNP的檢測;SSCP則很難滿(mǎn)足自動(dòng)化的需要,難以大規模開(kāi)展工作。因此,這些方法均未被廣泛采用。
SNP是分布在動(dòng)物基因組中非常常見(jiàn)的一種分子標記。在人體中每1000bp就可能有一個(gè)SNP。需找SNP的目的是為了做連鎖分析,在現在先進(jìn)的技術(shù)里,還可以做全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)。
然后說(shuō)說(shuō)標簽SNP,這個(gè)涉及到單倍型的問(wèn)題(對單倍型稍微講解一下!三個(gè)SNP假定是G、C突變,G、T突變和A、T突變,但不是說(shuō)這些突變在單倍體染色體上里是隨意組合的,而是趨向于一種組合方式,比如一條染色體是GGT,另一條是CCA)。因為在基因組中,有些區域是較為緊密連鎖在一起的,這個(gè)區域可大可小,組成一個(gè)單倍型框,在區域里也會(huì )存在多多少少的SNP。人們沒(méi)有必要把這些SNP都找出來(lái),因為它們往往就像是捆綁在一起的。于是從中選出一個(gè)代表性的SNP,它可以反映這個(gè)區域的情況。然后就方便人們繼續做關(guān)聯(lián)分析!繼人類(lèi)基因組計劃之后,還做了單倍型的圖譜。這也是標簽SNP的應用。講的夠清楚吧,呵呵……希望理解,謝謝。
1.限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP):由DNA 的多態(tài)性,致使DNA 分子的限制酶切位點(diǎn)及數目發(fā)生改變,用限制酶切割基因組時(shí),所產(chǎn)生的片段數目和每個(gè)片段的長(cháng)度就不同,即所謂的限制性片段長(cháng)度多態(tài)性,導致限制片段長(cháng)度發(fā)生改變的酶切位點(diǎn),又稱(chēng)為多態(tài)性位點(diǎn)。最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測,后來(lái)采用聚合酶鏈反應(PCR)與限制酶酶切相結合的方法。現在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長(cháng)度多態(tài)性。
2.單鏈構象多態(tài)性(SSCP):是一種基于單鏈DNA構象差別的點(diǎn)突變檢測方法。相同長(cháng)度的單鏈DNA如果順序不同,甚至單個(gè)堿基不同,就會(huì )形成不同的構象。在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后,進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí),靶DNA中若發(fā)生單個(gè)堿基替換等改變時(shí),就會(huì )出現泳動(dòng)變位(mobility shift),多用于鑒定是否存在突變及診斷未知突變。
SNP是分布在動(dòng)物基因組中非常常見(jiàn)的一種分子標記。
在人體中每1000bp就可能有一個(gè)SNP。需找SNP的目的是為了做連鎖分析,在現在先進(jìn)的技術(shù)里,還可以做全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)。
然后說(shuō)說(shuō)標簽SNP,這個(gè)涉及到單倍型的問(wèn)題(對單倍型稍微講解一下!三個(gè)SNP假定是G、C突變,G、T突變和A、T突變,但不是說(shuō)這些突變在單倍體染色體上里是隨意組合的,而是趨向于一種組合方式,比如一條染色體是GGT,另一條是CCA)。因為在基因組中,有些區域是較為緊密連鎖在一起的,這個(gè)區域可大可小,組成一個(gè)單倍型框,在區域里也會(huì )存在多多少少的SNP。
人們沒(méi)有必要把這些SNP都找出來(lái),因為它們往往就像是捆綁在一起的。于是從中選出一個(gè)代表性的SNP,它可以反映這個(gè)區域的情況。
然后就方便人們繼續做關(guān)聯(lián)分析!繼人類(lèi)基因組計劃之后,還做了單倍型的圖譜。這也是標簽SNP的應用。
講的夠清楚吧,呵呵……希望理解,謝謝。
SNP基因分型的常見(jiàn)方法有如下幾種:
1. TaqMan探針?lè )?針對染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設計PCR引物和TaqMan探針,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴增。探針的5'-端和3'-端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。當溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí),該探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而將探針5'-端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái),破壞兩熒光分子間的PRET,發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。
2.SNaPshot法 該技術(shù)由美國應用生物公司(ABI)開(kāi)發(fā),是基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術(shù),也稱(chēng)小測序,主要針對中等通量的SNP分型項目。在一個(gè)含有測序酶、四種熒光標記ddNTP、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5'-端的不同長(cháng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應體系中,引物延伸一個(gè)堿基即終止,經(jīng)ABI測序儀檢測后,根據峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對應的SNP位點(diǎn),根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類(lèi),從而確定該樣本的基因型。對于PCR產(chǎn)物模板可通過(guò)多重PCR反應體系來(lái)獲得。通常用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析。
3.HRM法 高分辨率熔解曲線(xiàn)分析(HRM)是近幾年興起的SNP研究工具,它通過(guò)實(shí)時(shí)監測升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結合情況,來(lái)判斷是否存在SNP,而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì )影響熔解曲線(xiàn)的峰形,因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)型的局限,無(wú)需序列特異性探針,在PCR結束后直接運行高分辨率熔解,即可完成對樣品基因型的分析。該方法無(wú)需設計探針,操作簡(jiǎn)便、快速,成本低,結果準確,并且實(shí)現了真正的閉管操作。
4.Mass Array法 MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具,通過(guò)引物延伸或切割反應與靈敏、可靠的MALDI-TOF-MS技術(shù)相結合,實(shí)現基因分型檢測。基于MassARRAY平臺的iPLEX GOLD技術(shù)可以設計最高達40重的PCR反應和基因型檢測,實(shí)驗設計靈活,分型結果準確性高。根據應用需要,對數十到數百個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行數百至數千份樣本檢測時(shí),MassARRAY具有最佳的性?xún)r(jià)比,特別適合于對全基因組研究發(fā)現的結果進(jìn)行驗證,或者是有限數量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。
5.Illumina BeadXpress法 采用Illumina公司的BeadXpress系統進(jìn)行批量SNP位點(diǎn)檢測,可以同時(shí)檢測1-384個(gè)SNP位點(diǎn),往往用于基因組芯片結果確認,適合高通量檢測。微珠芯片具有高密度、高重復性、高靈敏度、低上樣量、定制靈活等特點(diǎn),極高的集成密度,從而獲得極高的檢測篩選速度,在高通量篩選時(shí)可顯著(zhù)降低成本。
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