蛋白質(zhì)含量測定用什么方法方法(測定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)
1.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋 白質(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
2.蛋白質(zhì)含量的測定都有哪幾種方法,適用情況以及優(yōu)缺點(diǎn)
①凱氏定氮法 原理：蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。
當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強堿性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最后用標準酸滴定硼酸，通過(guò)標準酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 ②雙縮脲法 原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡(luò )合物。
蛋白質(zhì)中的肽鍵實(shí)際上就是酰胺鍵，故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲（biuret）反應，產(chǎn)生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質(zhì)含量。
缺點(diǎn)：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類(lèi)共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 （數mg），且會(huì )受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準確度 較高，不受蛋白質(zhì)的種類(lèi)影響。
③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑（堿性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應生成藍色物質(zhì)，600nm比色測定蛋白質(zhì)含量。 靈敏度較高（約 0.1 mg），但較麻煩，也會(huì )受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。
步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會(huì )有大誤差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進(jìn)行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標) ⑤色素結合法（Bradford 法） 直接測定法：利用蛋白質(zhì)與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進(jìn)行測定。 考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質(zhì)含量。
CBG 有點(diǎn)像指示劑，會(huì )在不同的酸堿度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候，因為蛋白質(zhì)會(huì )提供 CBG一個(gè)較為中性的環(huán)境，因此會(huì )變成藍色。
當樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多，藍色也會(huì )增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。
間接測定法：蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的多少。
⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法與Lowry法相似，主要差別在堿性溶液中，蛋白質(zhì)使Cu2+轉變Cu+后，進(jìn)一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產(chǎn)生深紫色，在波長(cháng)562 nm有強的吸收。 它的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與堿性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。
靈敏度Lowry法相似。 本方法對于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會(huì )受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法 膠體金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結合。 膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉變?yōu)樗{色，顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。
⑧其他方法 有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團，如 過(guò)氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長(cháng)的吸光來(lái)定量之。 含特殊金屬的酶 （如鎘），則可追蹤該金屬。
3.蛋白質(zhì)定量測定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時(shí)
8~10小時(shí) 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時(shí)太長(cháng)
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò )合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時(shí)間長(cháng)；操作要嚴格計時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
4.蛋白質(zhì)含量測定的基本方法有哪些
pro的測定方法分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量，另一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定pro含量。
但是食品種類(lèi)很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標準酸液吸收，用標準酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。
5.蛋白質(zhì)含量測定藥典規定必須用什么方法
使用凱氏定氮的方法檢測蛋白質(zhì)含量。
凱氏定氮法 凱氏定氮法
蛋白質(zhì)測定的國標規定方法——凱氏定氮法介紹
【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白質(zhì)的測定方法
本標準適用于各類(lèi)食品中蛋白質(zhì)的測定。
1 原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質(zhì)含量。
2 試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。
2.1 硫酸銅。
2.2 硫酸鉀。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時(shí)混合。
2.6 40%氫氧化鈉溶液。
2.7 0.05N硫酸標準溶液或0.05N鹽酸標準溶液。
3 儀器
定氮蒸餾裝置：如圖所示。
（圖略）
4 操作方法
4.1 樣品處理：精密稱(chēng)取0.2~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取10~20ml液體樣品（約相當氮30~40mg），移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶?jì)纫后w微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續加熱0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗。
4.2 按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶?jì)妊b水至約2/3處，加甲基紅指示液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jì)鹊乃?
4.3 向接收瓶?jì)燃尤?0ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開(kāi)始蒸餾。蒸氣通入反應室使氨通過(guò)冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jì)龋麴s5min。移動(dòng)接受瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標準溶液滴定至灰色或藍紫色為終點(diǎn)。
同時(shí)吸取10.0ml試劑空白消化液按4.3操作。
4.4 計算
式中：X——樣品中蛋白質(zhì)的含量，%；
V1——樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml;
V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml;
N——硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；
0.014——1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數；
m——樣品的質(zhì)量（體積），g(ml);
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數。蛋白質(zhì)中的氮含量一般為15~17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質(zhì)，乳制品為6.38，面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。
附加說(shuō)明：
本標準由全國衛生標準技術(shù)委員會(huì )食品衛生標準分委員會(huì )提出，由衛生部食品衛生監督檢驗所歸口。
本標準由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。
6.利用蛋白質(zhì)的成色反應測定蛋白質(zhì)的含量的方法有哪些
通常有三種方法：
(1)茚三酮反應（ninhydrin reaction）
蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應。除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應生成黃色物質(zhì)外，所有的α氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應生成藍紫色物質(zhì)。α氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱，反應后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應生成紫紅色，最終為藍色物質(zhì)。脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應生成黃色物質(zhì)。該反應可廣泛用于各種氨基酸的定性或定量測定。
(2)雙縮脲反應（biuret reaction）
蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱(chēng)為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來(lái)檢測蛋白質(zhì)水解程度。該反應是肽鍵常用的反應，即在堿性銅溶液中，肽鍵與銅離子形成絡(luò )合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。
(3)考馬斯亮藍法：
即蛋白質(zhì)與一種蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍G250反應形成復合物，該復合物在595nm有最大光吸收峰。
注意：蛋白質(zhì)遇硝酸也顯色為黃色，不過(guò)這樣蛋白質(zhì)就變性了。
