提取動(dòng)物rna的方法(動(dòng)物RNA的提取)
1.動(dòng)物RNA的提取
RNA的提取
一、準(zhǔn)備試劑：
氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。
二、操作步驟：
1. 勻漿處理：
a. 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b. 單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c. 細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10*106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1*107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。
2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000*g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000*g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000*g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500*g離心5分鐘，棄上清。
10. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。
三、注意事項(xiàng)：
1. 從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。
2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3. 分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī)，2600*g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1*106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ，腎3-4μg ，骨骼肌和腦組織1-1.5μg ，胎盤1-4μg ，上皮細(xì)胞8-15μg ，成纖維細(xì)胞5-7μg 。
2.RNA的提取方法有哪些
通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶無處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。 0 T3 z( F& _, D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步驟 - O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。
但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑：提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。
第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。（ O( g; ^+ K) f+ i& ]% P 實(shí)驗(yàn)步驟： * l& d6 s5 e( q1 F( g2 | j, ^0 s 破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。
6 D8 }. Q; Y, g* X 1、破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 " s% f, `0 [1 d* m! ]0 e2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。
& X. P) i) Y; L# u/ [3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或異丙醇。2 @0 d& z7 ?+ i, g1 @ 4、洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。
3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、融解RNA一般使用TE。 ; L5 f. n6 }( S1 t% Z& J6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。
為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。
另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。
用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。
當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M,12,000*g離心5分鐘。 & P3 [7 m* ^$ U$ _" ? : F" x u* N( ?( I氯化鋰法提取總RNA: " u; }' I! r' ^' ^& l 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。
# ~* S: }9 `* r4 Z3 P 試驗(yàn)試劑： " d$ r6 Q+ _. I8 Q1、氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】 7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 ！ m8 Q4 R, ]& y: b# `7 d試驗(yàn)步驟：7 [6 ?$ `* }; o7 _ Z' { 1、對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰-尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。& Y) b: E, Q" l/ ^ Q: \$ s 2、勻槳液在0-4℃放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘。
x- C6 D- N/ N0 K! t2 a 3、取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液，重復(fù)步驟2。 ) y- x) S0 K9 y6 j, e4、沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15-30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘。
3 d2 v' i1 ~( ~* D5、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，-20℃放置1小時(shí)，5000g離心。 L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、70%乙醇洗沉淀一次。
真空干燥。3 }; r0 [/ Q' G9 q 7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于-70℃保存。
0 f. X% R( H% B7 g ! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶-熱酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l 本方法適合于病毒RNA的提取 * I( i+ b# r! K試驗(yàn)試劑： $ ？4 [7 H9 `) J1、蛋白酶K（終濃度50ug/ml）, J5 p l6 V/ t7 [/ I 2、2*緩沖液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h, p ] y+ \$ Z) O 試驗(yàn)步驟：# W3 v8 G1 [$ ]5 y 1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘。 - K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n, {# d2、加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭，在65℃保溫5分鐘后再輕徭。
w! `; W( ~, E: i3 ^3、離心，取上清，氯仿抽提一次。， |（ Z0 d; j2 @7 m+ d2 Q& x H 4、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，-20℃放置1小時(shí)，5000g離心（10000g,10min）。
7 [/ w, h2 d6 U$ k5、70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
% A5 Y; {( w% ]3 a* y, O e) P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于-70℃保存。植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對策 植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對策 ） o5 B7 d/ Q3 _酚類化合物的干擾及對策： 。
3.RNA的提取方法步驟及原理.
RNA抽取一般使用Trizol法抽提：
Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進(jìn)行提取組織或細(xì)胞中的RNA。
Trizol作用原理：
在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。
水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。
擴(kuò)展資料
與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對原則形成一定的二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。
RNA的堿基配對規(guī)則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。
在細(xì)胞中，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA）,rRNA（核糖體RNA）,mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，內(nèi)容按照細(xì)胞核中的DNA所轉(zhuǎn)錄；tRNA是mRNA上堿基序列（即遺傳密碼子）的識(shí)別者和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質(zhì)合成的工作場所。
參考資料來源：百度百科-RNA
4.提取昆蟲RNA有哪些方法
1. 組織取材后，在酒精里泡一下立即放入凍存管，快速放入液氮.實(shí)驗(yàn)時(shí)，在液氮中將組織研磨成粉末，趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管.加入1ml Trizol，吸打均勻，靜置5min.
2. 加入200微升的氯仿，劇烈震蕩30s，室溫放置10min，離心15000r/min 4攝氏度 15s.
3. 此時(shí)，液體分3層，惜取上清液如EB管，加入等體積異丙醇，充分混勻，靜置10min；離心15000r/min 4攝氏度 10min
4. 棄上清液，加冰冷的75%酒精 洗滌2次，每次離心8000r/min 4攝氏度 10min
5. 靜置 4分鐘 干燥后 加入RNA-FREE 水
（僅供參考）
5.提取制備RNA常用的方法有哪幾種,各有何優(yōu)缺點(diǎn)
常見的RNA提取方法有苯酚法、陰離子去污劑法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、異硫氫酸胍法、CTAB法、熱硼酸法及改良熱硼酸法、TRIZOL試劑快速提取法。
RNA提取時(shí)，就變性劑的選擇來說，CTAB(CTAB法)比異硫氰酸胍（RIZOL試劑法）和 SDS（改良熱硼酸法）更有效；就CTAB法來說，由于以CTAB為變性劑，同時(shí)加入PVP和β一巰基乙醇共同作用變性蛋白、抑制RNase的活性，使用無水乙醇或異丙醇沉淀雜蛋白和總核酸等，然后再選擇性地分離出RNA。
6.RNA的提取方法
1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速離心后取上清，所得DNA大小為100-150kb
2、甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
3、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。
4、異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）
5、表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
6、加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。
7、堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。
擴(kuò)展資料：
DNA提取原則：
1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；
2、核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；
3、其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；
4、其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。
參考資料來源：百度百科——DNA提取
7.提取昆蟲RNA有哪些方法
組織取材后，在酒精里泡一下立即放入凍存管，快速放入液氮.實(shí)驗(yàn)時(shí)，在液氮中將組織研磨成粉末，趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管.加入1ml Trizol，吸打均勻，靜置5min.加入200微升的氯仿，劇烈震蕩30s，室溫放置10min，離心15000r/min 4攝氏度 15s. 此時(shí)，液體分3層，惜取上清液如EB管，加入等體積異丙醇，充分混勻，靜置10min；離心15000r/min 4攝氏度 10min棄上清液，加冰冷的75%酒精 洗滌2次，每次離心8000r/min 4攝氏度 10min靜置 4分鐘 干燥后 加入RNA-FREE 水 （僅供參考）。
