培養基的制備實(shí)驗中用到的消毒方法?(培養基滅菌的方法)
1.培養基滅菌的方法有哪些
培養基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。消毒時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，也不能超過(guò)規定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì )在高溫下分解，失去營(yíng)養作用，也會(huì )使培養基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無(wú)污染現象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時(shí)不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。
2、過(guò)濾滅菌：
一些植物生長(cháng)調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。細菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
2.培養基滅菌的方法有哪些
培養基的滅菌方法 1、高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。
培養基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。
消毒時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，也不能超過(guò)規定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì )在高溫下分解，失去營(yíng)養作用，也會(huì )使培養基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。
滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無(wú)污染現象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時(shí)不用的培養基最好置于10℃下保存。
含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。2、過(guò)濾滅菌：一些植物生長(cháng)調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。
細菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
3.培養基的制備與滅菌的實(shí)驗中配制培養基時(shí)要注意哪些問(wèn)題
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內.加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應經(jīng)常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱(chēng)取一定量培養基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(cháng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養成分被破壞.（2）校正酸堿度（調節pH）：培養基必須有適當的pH.因此測定pH是培養基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調節pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當調節緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會(huì )比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養基的pH會(huì )比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數據考察每種培養基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節.干燥培養基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗證.測定時(shí)，一般用指示劑滴入培養基觀(guān)察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調整pH后要加熱過(guò)濾，使培養基澄清.（3）培養基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養基前，則要采用無(wú)菌硅膠管.固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，如沾有培養基應用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用.分裝好的培養基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當天（2h內最佳）進(jìn)行滅菌處理.液體、半固體培養基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定.普通培養基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應延長(cháng)至20min.含糖培養基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌.高壓滅菌應嚴格按照操作規程執行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時(shí)間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗證確認，如不同類(lèi)型培養基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
4.微生物中的培養基的配制與滅菌的具體操作是怎樣的
培養基的配制與滅菌 1目的1.1了解并掌握培養基的配制、分裝方法1.2掌握各種實(shí)驗室滅菌方法及技術(shù)。
2原理 培養基是供微生物生長(cháng)、繁殖、代謝的混合養料。由于微生物具有不同的營(yíng)養類(lèi)型，對營(yíng)養物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗和研究的目的不同，所以培養基的種類(lèi)很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養角度分析，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)素以及水分等。
另外，培養基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用最廣的凝固劑。
加瓊脂制成的培養基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。
任何一種培養基一經(jīng)制成就應及時(shí)徹底滅菌，以備純培養用。一般培養基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。
3材料3.1器皿及材料 天平、稱(chēng)量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養皿及培養皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線(xiàn)繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。3.2藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
4流程 稱(chēng)藥品→溶解→調pH值→融化瓊脂→過(guò)濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。5步驟5.1培養基的制備5.1.1稱(chēng)量藥品 根據培養基配方依次準確稱(chēng)取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。
蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。5.1.2溶解 用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。
待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。
5.1.3調節pH 根據培養基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。
5.1.4溶化瓊脂 固體或半固體培養基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。
注意控制火力不要使培養基溢出或燒焦。5.1.5過(guò)濾分裝 先將過(guò)濾裝置安裝好（圖3-1）。
如果是液體培養基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。
分裝時(shí)注意不要使培養基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。
固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。5.1.6包扎標記 培養基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。
在包裝紙上標明培養基名稱(chēng)，制備組別和姓名、日期等。5.1.7滅菌 上述培養基應按培養基配方中規定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。
普通培養基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養基的有效成份。培養基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養基，則滅菌后立即擺放成斜面（圖3-2），斜面長(cháng)度一般以不超過(guò)試管長(cháng)度的1/2為宜；半固體培養基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。
5.1.8倒平板 將需倒平板的培養基，于水浴鍋中冷卻到45~50℃，立刻倒平板。5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類(lèi)。
本實(shí)驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。
通過(guò)加熱使菌體內蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。5.2.1.高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗中最常用的滅菌方法。
這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著(zhù)蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15~30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。
一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌（圖3-4）。5.2.1.1操作方法和注意事項如下 加水 打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線(xiàn)。
立式消毒鍋最好用已煮開(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。
裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。排氣 打開(kāi)排氣口（也叫放氣閥）。
用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。升壓、保壓和降壓 當鍋內冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。
當壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達。
5.實(shí)驗室常用的滅菌方法有哪些
(1)加熱滅菌法 利用高溫來(lái)殺死微生物（超過(guò)最高生長(cháng)溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當高溫作用于微生物時(shí)，首先引起細胞內生理生化反應速率加快，機體內對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著(zhù)溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導致細胞內原生質(zhì)體的變化、酶結構的破壞，從而使細胞失去了生活機能上的協(xié)調，停止了生長(cháng)發(fā)育。隨著(zhù)高溫的繼續作用，細胞內原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結構完全破壞，活動(dòng)消失，生化反應停止，滲透交換等新陳代謝活動(dòng)消失，細胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類(lèi)。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒(méi)有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱(chēng)為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡(jiǎn)單，故在生產(chǎn)上廣泛應用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱(chēng)焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來(lái)滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時(shí)間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時(shí)，可將壓力增加到0.152兆帕，延長(cháng)至1~2小時(shí)。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時(shí)，要完全排出鍋內的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時(shí)間，應根據待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類(lèi)型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。
它設備簡(jiǎn)單、成本低，當前使用最廣泛。只要砌一個(gè)爐灶，買(mǎi)1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過(guò)大，以裝800~1500瓶為好。
設計常壓灶時(shí)應注意的問(wèn)題：大小根據生產(chǎn)規模來(lái)定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內壁下流而不會(huì )打濕棉塞；灶倉內要有層架結構，以便分層裝入滅菌物；灶上應安裝溫度計，可隨時(shí)觀(guān)察灶內溫度的變化；因滅菌時(shí)間長(cháng)，鍋內水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節省燃料。菇農在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡(jiǎn)便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開(kāi)后保持8~10小時(shí)，悶一夜即可。
圖2-7 簡(jiǎn)易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內，100℃處理1小時(shí)左右，殺死微生物的營(yíng)養細胞，讓其冷卻至30℃左右，此時(shí)芽胞會(huì )萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復3次，可達到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營(yíng)養物、特殊培養基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時(shí)間，殺死有害微生物的方法。
適應于不耐高溫的物品消毒。有些培養基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營(yíng)養體，又能使培養基的成分不致受到嚴重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個(gè)原理殺死其中的病蟲(chóng)、雜菌。 （2）過(guò)濾除菌法 又分液體過(guò)濾和空氣過(guò)濾兩種，就是采用機械的方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器，通過(guò)機械過(guò)濾，只讓液體培養基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩定的體積小的液體培養基（如動(dòng)物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過(guò)過(guò)濾滅菌形成無(wú)菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來(lái)造成工作臺范圍的無(wú)菌狀態(tài)。
過(guò)濾滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過(guò)濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱(chēng)輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線(xiàn)、β-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)、X-射線(xiàn)、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線(xiàn)、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線(xiàn)滅菌 紫外線(xiàn)殺菌的原理是利用紫外線(xiàn)的輻射作用。用燈管直接照射細菌使其發(fā)生光化學(xué)反應，將細菌細胞質(zhì)誘導形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線(xiàn)照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線(xiàn)的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養室的上方，個(gè)數依房間大小而定，容1~2個(gè)人操作的接種室，安裝一個(gè)30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應將所需的器具一起放入接種室（箱）內，然后打開(kāi)紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開(kāi)燈照射2小時(shí)。
