制備核酸探針的方法(目前常用的核酸探針)
1.目前常用的核酸探針有哪些
核酸探針的種類(lèi) 1.按來(lái)源及性質(zhì)劃分 可將核酸探針?lè )譃榛蚪MDNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類(lèi)。
作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應用最為廣泛，它的制備可通過(guò)酶切或聚合酶鏈反應（PCR）從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質(zhì)粒或噬菌體載體中，隨著(zhù)質(zhì)粒的復制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。
將 RNA進(jìn)行反轉錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測。
cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)粒或噬菌體中，以便大量制備。 將信息RNA(mRNA)標記也可作為核酸分子雜交的探針。
但由于來(lái)源極不方便，且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應用較少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應用十分廣泛，可根據需要隨心所欲合成相應的序列，可合成僅有幾十個(gè)bp的探針序列，對于檢測點(diǎn)突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用 2.按標記物劃分 有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類(lèi)。
放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應用最廣泛的探針標記物。
常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應用最普遍。
放射性標記的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測到Pg級；缺點(diǎn)是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩定、成本高等。因此，放射性標記的探針不能實(shí)現商品化。
目前，許多實(shí)驗室都致力于發(fā)展非放射性標記的探針。 目前應用較多的非放射性標記物是生物素（Biotin）和地高辛（digoxigenin）。
二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素，對親和素有獨特的親和力，兩者能形成穩定的復合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)（如酶、熒光素等）進(jìn)行檢測。
地高辛是一種類(lèi)固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測，原理類(lèi)似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當，而特異性?xún)?yōu)于生物素標記，其應用日趨廣泛。
2.核酸分子雜交的主要實(shí)驗方法有哪些
雜交過(guò)程是高度特異性的，可以根據所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子（heteroduplex）。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。使雙螺旋解開(kāi)成為單鏈，因此，變性技術(shù)也是核酸雜交的一個(gè)環(huán)節。
雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細胞總DNA或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交，即細胞原位雜交。探針必須經(jīng)過(guò)標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素，但由于同位素的安全性，近年來(lái)發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法。
3.分子雜交技術(shù)的核酸探針標記法
核酸探針根據核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針；根據是否使用放射性標記物的與否，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。
下面將介紹各種類(lèi)型的探針及標記方法。 分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。
雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：切口平移法和隨機引物合成法。1. 切口平移法（nick translation） 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí)，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。
同時(shí)該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性，能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補上核苷酸，從而使切口沿著(zhù)DNA鏈移動(dòng)，用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。
最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響： （a） 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。
（b） DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì )影響產(chǎn)物片段的大小。（c） DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì )抑制酶的活性， 故應使用仔細純化后的DNA。
材料： 待標記的DNA。設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：（1）10*切口平移緩沖液：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。(2)未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外，其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ（4單位/μ l）：溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
（5）DNA酶Ⅰ：1mg/ml。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。操作步驟：（1） 按下列配比混合：未標記的dNTP 10μl10*切口平移緩沖液 5μl待標記的DNA 1μg[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶 4單位DAN酶 I 1μl加水至終體積 50μl(2) 置于15℃水浴60分鐘。
（3） 加入5μl EDTA終止反應。（4） 反應液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L， 加入兩倍體積預冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意]1、3H,32P及35S標記的dNTP都可使用于探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長(cháng)度比較短。
隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴(lài)于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。
通常，產(chǎn)物平均長(cháng)度為400-600個(gè)核苷酸。利用隨機引物進(jìn)行反應的優(yōu)點(diǎn)是：（1）Klenow片段沒(méi)有5'→3'外切酶活性，反應穩定，可以獲得大量的有效探針。
（2）反應時(shí)對模板的要求不嚴格，用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進(jìn)行反應。（3）反應產(chǎn)物的比活性較高，可達4*109 cpm/μg探針。
（4）隨機引物反應還可以在低熔點(diǎn)瓊脂糖中直接進(jìn)行。材料：待標記的DNA片段。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：（1）隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚(yú)精子DNA）。
(2)10*隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。
（4）20mmol/L DTT。(5)未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。(7)緩沖液A:50mmol/L Tris·Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。
操作步驟：（1） 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物（1μl）混合后置于eppendorf管內，水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。（2） 與此同時(shí)，盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl未標記的dNTP溶液 1μl10*隨機標記緩沖液 1μl[α-32 P] dATP（比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl） 3μlddH2O 1μl(3) 將步驟（1）eppendorf管中的溶液移到步驟（2）管中。
（4） 加入5單位（約1μl） Klenow片段， 充分混合，在微型離心機中以12000g離心1-2秒， 使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3-16小時(shí)。（5） 在反應液中加入10μl緩沖液A后，將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。
同時(shí)計算放射比活性。[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時(shí)，反應產(chǎn)物比較短，但產(chǎn)物的累積較多；反之，則可獲得較長(cháng)片段的探針。
2、模板DNA應是線(xiàn)性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。 用雙鏈探針雜交檢測另一個(gè)遠緣DNA時(shí)，探針序列與被檢測序列間有很多錯配。
而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定，即形成自身的無(wú)效雜交，結果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問(wèn)題。
單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：（1） 以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針； （2） 以RNA為模板， 用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。1. 從M13載體衍生序。
4.核酸分子雜交的主要實(shí)驗方法有哪些
雜交過(guò)程是高度特異性的，可以根據所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。
其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子（heteroduplex）。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。
使雙螺旋解開(kāi)成為單鏈，因此，變性技術(shù)也是核酸雜交的一個(gè)環(huán)節。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。
該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細胞總DNA或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交，即細胞原位雜交。
探針必須經(jīng)過(guò)標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素，但由于同位素的安全性，近年來(lái)發(fā)展了許多非同位素標記探針的方法。
5.有幾種核酸標記的方法
通過(guò)核酸標記技術(shù)可將細胞因子cDNA作為基因探釗檢測細胞內細胞因子 基因組 DNA或mRNA。主要有以下幾種方法：
1.應用同位素（或非同位素）標記的cDNA探針，檢測經(jīng)Northern blot后細胞因子mRNA水平或采用打點(diǎn)雜交法。
2.應用標記cDNA探釗與細胞或組織切片進(jìn)行原位雜交，然后進(jìn)行放射自顯影。
3.細胞因子mRNA經(jīng)反轉錄為cDNA，用特異性細胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR）擴增細胞因子cDNA,Southern blot后用標記探針檢測特異細胞因子DNA水平。
