腸道菌群檢測方法(腸道致病菌的分類(lèi)及常用檢測方法)

1.腸道致病菌的分類(lèi)及常用檢測方法

根據可培養細菌的數量分類(lèi)在腸道菌群中，可以培養到的細菌有400余種，依據其數量多少可以分為主要（優(yōu)勢）菌群（predominant microflora）和次要菌群（sub—dominant microflora）。

①主要（優(yōu)勢）菌群：指腸道菌群中數量大或種群密集度大的細菌，一般在10~10cfu/g以上，包括類(lèi)桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專(zhuān)性厭氧菌，通常屬于原籍菌群。優(yōu)勢菌群是對宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著(zhù)整個(gè)菌群的功能，決定著(zhù)菌群對宿主的生理病理意義。

②次要菌群：數量在10~10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動(dòng)性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過(guò)路菌群。檢測方法：1、采樣及稀釋 （1）按無(wú)菌操作法將檢樣25g（或25mL）放于含有225mL無(wú)菌水的三角瓶中（瓶?jì)阮A置適當數量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。

固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以8000~10000r/min的速度離心1min，做成1:10的稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1Ml，注入含有9mL無(wú)菌水的試管內，振搖混勻，做成1:100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀釋液。

（3）根據食品的衛生要求或對檢驗樣品污染情況的估計，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。

2、乳糖初發(fā)酵試驗 即通常所說(shuō)的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。

每一個(gè)稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。3、分離培養 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線(xiàn)接種于伊紅美藍瓊脂平板，置36±1℃溫箱內培養18~24h，然后觀(guān)察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色、鏡檢并作復發(fā)酵試驗。

4、乳糖復發(fā)酵試驗 即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗，其目的在于證明經(jīng)乳糖初發(fā)酵試驗呈陽(yáng)性反應的試管內分離到的革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述選擇性EMB培養基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1~2個(gè)進(jìn)行革蘭染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±l℃溫箱內培養24±2小時(shí)，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。

凡乳搪發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭染色為陰性反應的無(wú)芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽(yáng)性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭染色為陽(yáng)性，則報告為大腸菌群陰性。擴展資料：有益菌菌群的生理功能：如果腸內有益菌菌群占優(yōu)，腸內黏膜呈現粉紅色，表示腸內環(huán)境相當良好。

1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄 在胃部分解消化的食物，經(jīng)由小腸吸收營(yíng)養后，成為粘稠狀物體送至大腸。然后再經(jīng)過(guò)18小時(shí)將水分及礦物質(zhì)吸收，就變成容易排泄的糞便。

腸道內環(huán)境良好時(shí)，糞便的軟硬適中，排便會(huì )較為順利。2、緩和的蠕動(dòng)，能順利將糞便排出 藉由腸的蠕動(dòng)，將糞便緩慢的推送至肛門(mén)。

如果蠕動(dòng)過(guò)快或太慢，都將影響糞便的構成，導致便秘或者腹瀉。而如果腸內干凈，則蠕動(dòng)的速度就相當的有規律，糞便可順利排出。

3、有助維他命的合成 比菲德氏菌等好菌能維護肌膚的健康，并具有合成有助熱量產(chǎn)生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關(guān)的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會(huì )不斷繁殖，維他命的合成也可順利進(jìn)行。

4、迅速排出有害物質(zhì) 健康的腸道并非完全沒(méi)有壞菌的存在，有害物質(zhì)多少會(huì )產(chǎn)生。當然還包括，吃進(jìn)體內的食品化學(xué)添加物或是無(wú)法成為營(yíng)養成分的物質(zhì)。

只要腸內環(huán)境良好，這些物質(zhì)在開(kāi)始危害身體前就被排出體外。5、避免病原菌的侵害 比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身體的免疫機能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質(zhì)，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內繁殖。

腸道有益菌菌群除了以上功能之外，對人體還有營(yíng)養作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對人類(lèi)的毛發(fā)具有重要的作用，當缺少這些營(yíng)養元素，會(huì )導致頭發(fā)脫落或毛發(fā)發(fā)黃、發(fā)叉，容易折斷等現象。

參考資料來(lái)源：百度百科-腸道菌群。

2.大腸菌群檢測方法及說(shuō)明

一、大腸菌群介紹 大腸菌群并非細菌學(xué)分類(lèi)命名，而是衛生細菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，它不代表某一個(gè)或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。

一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸菌群分布較廣，在溫血動(dòng)物糞便和自然界廣泛存在。

調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動(dòng)物糞便、人類(lèi)經(jīng)常活動(dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。

大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來(lái)的，主要是以該菌群的檢出情況來(lái)表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。

糞便是人類(lèi)腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時(shí)也會(huì )有一些腸道致病菌存在（如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著(zhù)腸道致病菌污染的可能性，潛伏著(zhù)食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 大腸菌群是評價(jià)食品衛生質(zhì)量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛生工作中。

二、大腸菌群檢驗方法： 由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行。

目前國內采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業(yè)標準。兩個(gè)標準方法在檢測程序上略有不同。

（一）國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養和證實(shí)試驗。 乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。

36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。 分離培養：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18-24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。

證實(shí)試驗：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀(guān)察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養24±2h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。

報告：根據證實(shí)為大腸桿菌陽(yáng)性的管數，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。 具體操作參見(jiàn)GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標準 食品衛生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》 （二）原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。

本方法采用兩步法： 推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。

證實(shí)試驗：將產(chǎn)氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性。

查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。 具體操作參見(jiàn) SN0169-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》 三、說(shuō)明： 1.MPN檢索表： MPN 為最大可能數（Most Probable Number）的簡(jiǎn)稱(chēng)。

這種方法，對樣品進(jìn)行連續系列進(jìn)行稀釋?zhuān)尤肱囵B基進(jìn)行培養，從規定的反應呈陽(yáng)性管數的出現率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數最近似的數值。 MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數字應相應降低或增加10倍。

注意國家標準和行業(yè)標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結果報告單位也不相同。 2.初發(fā)酵和證實(shí)試驗： 無(wú)論是國家標準的三步法還是行業(yè)標準的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗，培養基的配制略有不同，但都是為了證實(shí)培養物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。

初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗后，有時(shí)可能成為陰性。有數據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗相差較大。

因此，在實(shí)際檢測工作中，證實(shí)試驗是必需的。 3.產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還小），有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。

實(shí)驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿(mǎn)氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進(jìn)一步試驗。

4.挑選菌落： 國家標準中，需要對初發(fā)酵陽(yáng)性培養物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀(guān)察和證實(shí)試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱(chēng)，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。

國家標準方法規定伊紅美藍平板為分離培養基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。 另外，挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌。