基因工程轉化方法(基因工程中轉化的方法)

1.基因工程中轉化的方法有哪些

通過轉化將載體DNA導入受體菌繼而得到含有目的DNA插入的轉化菌株是構建DNA文庫最為關鍵的一步。

化學法（化學藥物如氯化鈣等）轉化

氯化鈣法轉化細胞 細菌處于0℃及CaCl2低滲溶液中時，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱擊處理促進細胞吸收DNA復合物。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。具體做法：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別載人不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。但這種方法工作量大，具有一定的盲目性。20世紀80年代以后，隨著DNA核苷酸序列分析技術的發(fā)展，人們已經可以通過DNA序列自動測序儀對提取出的基因進行核苷酸序列分析，并且通過一種擴增DNA的新技術（也叫PCR技術），使目的基因片段在短時間內成百萬倍地擴增。上述新技術的出現(xiàn)大大簡化了基因工程的操作技術。

2.轉基因技術的轉化方法

遺傳轉化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株通?？煞殖蓛纱箢?，第一類需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養(yǎng)，比較成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中國科學家提出的。

農桿菌介導轉化農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。

因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區(qū)，借助農桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株。

農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，自從技術瓶頸被打破之后，農桿菌介導轉化在單子葉植物中也得到了廣泛應用，其中水稻已經被當作模式植物進行研究。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體。

該方法于80年代初期由中國學者周光宇提出，中國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

核顯微注射法核顯微注射法是動物轉基因技術中最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因注射到受精卵細胞的原核內，注射的外源基因與胚胎基因組融合，然后進行體外培養(yǎng)，最后移植到受體母畜子宮內發(fā)育，這樣分娩的動物體內的每一個細胞都含有新的DNA片段。

-這種方法的缺點是效率低、位置效應（外源基因插入位點隨機性）造成的表達結果的不確定性、動物利用率低等，在反芻動物還存在著繁殖周期長，有較強的時間限制、需要大量的供體和受體動物等特點。詳細步驟：在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。

用這種方法生產的動物約有十分之一是整合外源基因的轉基因動物?；驑尫ɡ没鹚幈ɑ蚋邏簹怏w加速（這一加速設備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。

與農桿菌轉化相比，基因槍法轉化的一個主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質粒的構建也相對簡單，因此也是轉基因研究中應用較為廣泛的一種方法。

精子介導法精子介導的基因轉移是把精子作適當處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給發(fā)情母畜授精。

在母畜所生的后代中，就有一定比例的動物是整合外源基因的轉基因動物。同顯微注射方法相比，精子介導的基因轉移有兩個優(yōu)點：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10。

其次，由于它不涉及對動物進行處理，因此，可以用生產牛群或羊群進行實驗，以保證每次實驗都能夠獲得成功。核移植轉基因法體細胞核移植是一種轉基因技術。

該方法是先把外源基因與供體細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細胞上，然后將供體細胞細胞核移植到受體細胞——去核卵母細胞，構成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉基因的克隆動物。體細胞核移植法先在體外培養(yǎng)的體細胞中進行基因導入，篩選獲得帶轉基因的細胞。

然后，將帶轉基因體細胞核移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。重構胚胎經移植到母體中，產生的仔畜百分之百是轉基因動物。

3.基因工程包括哪些步驟

基因工程的主要操作步驟包括：⑴目的基因的制備，所謂目的基因就是按照設計所需要轉移的具有遺傳效應的DNA片段。

目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸內切酶從基因組中直接切割得到。⑵目的基因與克隆載體的重組，所謂克隆載體就是承載和保護目的基因帶入受體細胞的運載者，如質粒，λ噬菌體，病毒等。

⑶重組體轉入受體細胞，所謂受體細胞就是接受外源目的基因的細胞，大腸桿菌是用得最多的原核細胞受體，另外，動物細胞、植物細胞都可作為受體細胞，把帶有目的基因的重組體轉入受體細胞要用到各種物理的、化學的和生物的方法。⑷克隆子的篩選和鑒定，帶有目的基因的克隆子有沒有組合到受體細胞的基因組中去，目的基因有沒有在宿主細胞中通過轉錄、翻譯表達出預先設計中想要得到的產物和表達產物如何分離、純化等技術內容。