大腸桿菌菌種的制備(大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備要注意哪些因素)

1.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備要注意哪些因素

(1)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度： 用于轉化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)的，轉化率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì )使轉化率下降。

一般地，DNA溶液的體積不應超過(guò)感受態(tài)細胞體積的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實(shí)驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉化。

此外，重組DNA分子的構型與轉化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉化率較分子量相同的線(xiàn)性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構成環(huán)狀雙螺旋分子。 （2）感受態(tài)細胞的質(zhì)量： 所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃ （3）細胞的生長(cháng)狀態(tài)和密度 最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。

不要用已經(jīng)過(guò)多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長(cháng)密度以每毫升培養液中的細胞數在5*107個(gè)左右為佳。

即應用對數期或對數生長(cháng)前期的細菌，可通過(guò)測定培養液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0.5時(shí)，細胞密度在5*107個(gè)/ml左右。

（應注意OD600值與細胞數之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過(guò)高或不足均會(huì )使轉化率下降。

（二）感受態(tài)細胞轉化中的影響： 整個(gè)操作過(guò)程均應在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì )影響轉化效率或雜DNA的轉入。

整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細胞轉化率將會(huì )降低。

2.感受態(tài)細胞的制備時(shí)有什么注意事項

方法一：細菌轉化的方法多以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現為基礎，其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉化。

用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌。本法適用于大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。

操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下。1.從37℃培養16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過(guò)夜培養物，轉到一個(gè)含有100mlLB培養基的1L或500ml燒瓶中。

于37℃劇烈振搖培養約2~3h（旋轉搖床200~300r/min），每隔20~30min測量OD600值≈0.4。2.在無(wú)菌條件下將細菌轉移到一個(gè)，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10~20min。

3.于4℃用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。4.倒數培養液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養液流盡。

5.以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。6.于4℃用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。

7.倒出培養液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養液流盡。8.每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1MCaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。

9.用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物（體積≤10μl,DNA≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。10.將離心管放到預加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s~2min，不要搖動(dòng)試管。

11.快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min。12.每離心管加800μlSOC培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。

13.將適當體積（每個(gè)90mm平板可達200μl）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/lMgSO4和相應抗生素的SOB培養基上。14.將平板置于室溫至液體被吸收。

15.倒置平皿，于37℃培養，12~16h后可出現菌落。方法二：CASsuperOne-采用一種簡(jiǎn)單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，便于質(zhì)粒DNA的轉化，可滿(mǎn)足一般實(shí)驗的要求。

與CaCl2法相比具有多種優(yōu)點(diǎn)：使用方便，只需一步即可完成感受態(tài)細胞的制備；轉化效率略高于CaCl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿(mǎn)足一般實(shí)驗需要；感受態(tài)細胞制成后即可保存于-70℃，無(wú)須加入甘油，并且經(jīng)長(cháng)期保存活力無(wú)明顯下降。準備工作：1.從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線(xiàn)，37度過(guò)夜至長(cháng)出單菌落。

挑形態(tài)飽滿(mǎn)的單菌落2個(gè)，分別接種5mlLB培養基中，37℃，250rpm，過(guò)夜培養。2.次日從5mlLB培養物吸取200μl轉入50mlLB培養基中（250ml錐形瓶），37℃，250rpm培養2小時(shí)，此時(shí)OD600約0.4—0.5。

感受態(tài)細胞的制備：3.吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。4.加入100μl預冷的SolutionA，懸浮菌體，冰浴30分鐘。

5.此時(shí)感受態(tài)細胞已經(jīng)制成可立即使用或-70℃保存。細胞轉化：6.在感受態(tài)細胞中加入100pg-10ngDNA，混勻，冰浴30分鐘，然后42℃1分鐘熱擊，再次冰浴2分鐘。

加入0.9mlLB培養基，20μlSolutionB,37℃，振蕩培養1小時(shí)。7.取適當菌液（100-200μl）涂布相應抗性的平板。

8.過(guò)夜培養約16個(gè)小時(shí)，數菌落數，計算轉化率。補充說(shuō)明：1.所用器具一定要清潔；2.操作步驟2中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml錐形瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；3.在收獲菌體前半小時(shí)還可以在培養基中加入20mM的MgCl2，效果會(huì )更好一些；4.為保證細胞處于對數生長(cháng)期，培養后的菌體的OD值不要高于0.6;5.制備感受態(tài)細胞時(shí)所有操作盡量保證在冰上操作；6.細胞轉化操作步驟6中也可以不必進(jìn)行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB，簡(jiǎn)化操作步驟，但轉化效率低于熱擊方法，適用于對轉化率要求不高的實(shí)驗。

方法三：1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2mlLB培養基的試管中，37℃振蕩培養過(guò)夜2、取0.1ml過(guò)夜培養物轉種于含10mlLB培養基的三角瓶中，37℃振蕩培養3h至OD600=0.3ml離心管中，冰浴10min。4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液7、將菌體懸浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。

方法四：（1）將1ml過(guò)夜培養的細菌（如DH52、TG1、TM101）接種于100ml2*YT培養于500ml燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通常≥200rpm培養的細菌密度約OD550=0.2~0.5(5*107cells/ml)，需2~4h。

(2)將培養物放于冰上致冷10min，于4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。(3)棄除上清，將細菌懸浮于原始培養體積的一半（約50ml）的50mMCaCl2和10mmTris·HCl(pH8.0)無(wú)菌冷凍液體中。

（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。(5)棄上清，懸浮細菌于原始培養體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl(pH8.0)無(wú)菌冷凍中。

此時(shí)的細。

3.大腸桿菌發(fā)酵的實(shí)驗步驟 詳細點(diǎn)(比如操作過(guò)程中的注意事項) 謝謝

1、種子接種：將凍干管或甘油管種子接種到LB培養基搖瓶中進(jìn)行活化，一般可以加抗性標記對應的抗生素。然后搖床恒溫培養。

2、發(fā)酵培養基準備：搖瓶的話(huà)好說(shuō)，滅菌鍋就行。發(fā)酵罐的話(huà)，要先將罐子清洗干凈，然后配料，然后滅菌。

3、將培養好的種子液，按一定的接種量接到發(fā)酵培養基中。如果是搖瓶發(fā)酵的話(huà)一般不用中控，時(shí)間到了放瓶即可。如果是發(fā)酵罐發(fā)酵的話(huà)，中間過(guò)程需要補料、調節PH值、控制好溶氧轉速等等。要注意取樣時(shí)樣液的密封性，如果樣液到處亂撒，容易導致噬菌體污染。

4、不論是產(chǎn)酶、蛋白、氨基酸還是別的什么，產(chǎn)物量都是必須檢測的哦。

5、放罐后，也要注意料液的收集、使用和滅活，嚴防噬菌體污染。

4.大腸桿菌菌種液的配制具體步驟

復蘇：

配制LB固體培養基，高壓蒸汽滅菌，倒平板。

挑取菌種，在培養基上劃線(xiàn)。

37℃培養24h至長(cháng)出菌落。

搖菌

配制LB液體培養基。高壓蒸汽滅菌。

無(wú)菌試管內加入3ml LB培養基，挑取單菌落加入培養基中，37℃，200rpm搖菌過(guò)夜。

擴大培養：

配制LB液體培養基。高壓蒸汽滅菌。

三角瓶中加入50ml液體LB培養基，加入1ml菌液，37℃，200rpm搖菌至所需OD值。

注：培養基內需加入菌株所具有抗性的抗生素。

工具：超凈工作臺、酒精燈、接種針、試管、高壓滅菌鍋、培養皿等。

注意無(wú)菌操作。