利用薄層層析分析蛋黃脂質(zhì)的(薄層色譜操作注意事項(xiàng))
1.薄層色譜操作注意事項(xiàng)
去百度文庫(kù)，查看完整內(nèi)容>
內(nèi)容來(lái)自用戶(hù)：lhxiao2010
薄層色譜操作注意事項(xiàng)
影響薄層色譜分析的因素有很多，比如樣品處理方法、薄層板制備技巧、點(diǎn)樣方法、展開(kāi)劑的遴選、溫濕度的掌控等等很多方面，在這里對(duì)其操作要點(diǎn)作一下簡(jiǎn)單介紹：
1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)稀：過(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。
薄層色譜用于定量時(shí)，點(diǎn)樣是最主要的誤差來(lái)源。
供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開(kāi)，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開(kāi)，3
2.薄層層析法具體操作注意事項(xiàng)是什么?
鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)稀：過(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。
勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。
勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么明顯。
通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。 點(diǎn)樣 盡量用小的點(diǎn)樣管。
如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。 這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。
樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。
點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。 展開(kāi)劑配制 選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開(kāi)劑。
絕對(duì)不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開(kāi)缸，振搖展開(kāi)缸來(lái)配制展開(kāi)劑。混合不均勻和沒(méi)有分液的展開(kāi)劑，會(huì)造成層析的完全失敗。
各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。 展開(kāi)系統(tǒng)的飽和 一般使用的是雙槽的展開(kāi)缸，一槽用來(lái)放展開(kāi)劑，另一槽可加入氨水或硫酸。
把待展開(kāi)的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架著，蓋上展開(kāi)缸的蓋子。讓展開(kāi)劑的蒸氣充滿(mǎn)展開(kāi)缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半個(gè)小時(shí)左右。
展開(kāi)時(shí)難免要打開(kāi)蓋子把薄層板放入展開(kāi)劑中，不過(guò)對(duì)薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)該盡量輕、快。 溫濕度的控制 溫濕度對(duì)薄層影響都很大。
不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。
溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過(guò)在另一展開(kāi)槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 顯色 噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。
3.色譜分離技術(shù)中,薄層色譜的基本操作過(guò)程及注意事項(xiàng)
薄層色譜操作注意事項(xiàng)
影響薄層色譜分析的因素有很多，比如樣品處理方法、薄層板制備技巧、點(diǎn)樣方法、展開(kāi)劑的遴選、溫濕度的掌控等等很多方面，在這里對(duì)其操作要點(diǎn)作一下簡(jiǎn)單介紹：
1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)稀：過(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。
2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。
薄層色譜用于定量時(shí)，點(diǎn)樣是最主要的誤差來(lái)源。
供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開(kāi)，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開(kāi)，Kaiser稱(chēng)之為“上樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)。這種效應(yīng)對(duì)隨后的先行展開(kāi)造成很不利的影響。
供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留，也會(huì)改變展開(kāi)的選擇性，特別是供試液的溶劑與展開(kāi)劑的極性相差較大時(shí)更明顯。再者，親水性溶劑殘留在原點(diǎn)吸收大氣中的水分（特別在高濕度環(huán)境）對(duì)色譜的影響也不可低估。因此點(diǎn)樣時(shí)的同步干燥或繼后干燥以除去原點(diǎn)殘存的溶劑是需要的。但應(yīng)盡可能避免高溫加熱，如用吹風(fēng)筒加熱，樣品變?yōu)楣虘B(tài)后，部分或全部強(qiáng)烈的吸附在吸附劑的顆粒上，而促進(jìn)了硅膠的有催化作用的活性表面故態(tài)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致樣品的變性（尤其熱不穩(wěn)定物質(zhì)），至少移動(dòng)相在展開(kāi)時(shí)對(duì)這部分樣品的溶解速度比移動(dòng)速度慢得多而形成拖尾（斑點(diǎn)拖尾的原因之一）。
4.利用薄層色譜對(duì)藥物進(jìn)行鑒別和雜質(zhì)檢查時(shí)應(yīng)注意哪些操作事項(xiàng)
薄層色譜法（The layer chromatography,TLC）是將固定相均勻的涂布在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法，它屬于平板色譜，是一種常用的色譜分離方法。
TLC法被許多國(guó)家藥典用于藥物中雜質(zhì)的檢查、藥物分析等方面，且是目前藥典中收載最多的鑒別與有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、分離速度快，靈敏度和分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)。
而薄層色譜在藥物分析中，則常用薄層色譜掃描法，其主要用于以下幾個(gè)方面：
1、中藥材與中成藥的鑒別與成分分析
2、合成藥物及其制劑分析
3、藥物代謝研究
4、抗菌素分析
5、中藥的TLC指紋圖譜鑒別
高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。
是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來(lái)的一種高效、快速、高選擇性、高靈敏度的新型分離分析技術(shù)，是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展。
高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用主要是鑒別相關(guān)物質(zhì)、檢查藥物中有關(guān)物質(zhì)的含量限度，測(cè)定有效成分或主要成分含量。
1、在藥物鑒別中的應(yīng)用
在HPLC法中，保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別，在中國(guó)藥典中就有大量的藥物采用此法進(jìn)行鑒別。
2、在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用
歷年來(lái)各國(guó)藥典中收載了多種藥物采用HPLC法進(jìn)行雜質(zhì)檢查的方法，并且可采用HPLC法進(jìn)行雜質(zhì)檢查的藥物種類(lèi)在逐年頒布的藥典中有所增加。
3、在含量測(cè)定中的應(yīng)用
用高效液相色譜法測(cè)定合成藥及其制劑的含量，可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存藥物的干擾。
5.薄層色譜基本操作有哪幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù) 各項(xiàng)操作應(yīng)該注意什么
薄層色譜（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，又稱(chēng)薄層層析，屬于固-液吸附色譜。是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線(xiàn)，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來(lái)精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來(lái)判斷反應(yīng)是否完成。
薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10*3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線(xiàn)上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開(kāi)劑的展開(kāi)槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開(kāi)劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。
注意事項(xiàng)：
1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)稀：過(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。 2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。 薄層色譜用于定量時(shí)，點(diǎn)樣是最主要的誤差來(lái)源。 供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開(kāi)，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開(kāi)，Kaiser稱(chēng)之為“上樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)。這種效應(yīng)對(duì)隨后的先行展開(kāi)造成很不利的影響。 供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留，也會(huì)改變展開(kāi)的選擇性，特別是供試液的溶劑與展開(kāi)劑的極性相差較大時(shí)更明顯。再者，親水性溶劑殘留在原點(diǎn)吸收大氣中的水分（特別在高濕度環(huán)境）對(duì)色譜的影響也不可低估。因此點(diǎn)樣時(shí)的同步干燥或繼后干燥以除去原點(diǎn)殘存的溶劑是需要的。但應(yīng)盡可能避免高溫加熱，如用吹風(fēng)筒加熱，樣品變?yōu)楣虘B(tài)后，部分或全部強(qiáng)烈的吸附在吸附劑的顆粒上，而促進(jìn)了硅膠的有催化作用的活性表面故態(tài)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致樣品的變性（尤其熱不穩(wěn)定物質(zhì)），至少移動(dòng)相在展開(kāi)時(shí)對(duì)這部分樣品的溶解速度比移動(dòng)速度慢得多而形成拖尾（斑點(diǎn)拖尾的原因之一）。
3 展開(kāi)劑配制 選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開(kāi)劑。絕對(duì)不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開(kāi)缸，振搖展開(kāi)缸來(lái)配制展開(kāi)劑。混合不均勻和沒(méi)有分液的展開(kāi)劑，會(huì)造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。 4 展開(kāi)系統(tǒng)的飽和 一般使用的是雙槽的展開(kāi)缸，一槽用來(lái)放展開(kāi)劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開(kāi)的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架著，蓋上展開(kāi)缸的蓋子。讓展開(kāi)劑的蒸氣充滿(mǎn)展開(kāi)缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半個(gè)小時(shí)左右。展開(kāi)時(shí)難免要打開(kāi)蓋子把薄層板放入展開(kāi)劑中，不過(guò)對(duì)薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)該盡量輕、快。 5 溫濕度的控制 溫濕度對(duì)薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過(guò)在另一展開(kāi)槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 6 TLC通用顯色方法 通用顯色方法主要有： 1、紫外照射法：方便、不破壞樣品； 2、碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用； 3、熒光試劑：制造熒光背景，使原來(lái)紫外下無(wú)熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯； 4、硫酸溶劑：對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性。
