測定蛋白質(zhì)不同結構的方法(測定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)

1.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋 白質(zhì)溶液測定的方法。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。

在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。

這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。

完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。

因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。

如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。

2.蛋白質(zhì)含量測定的不同方法比較

蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來(lái)的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10~20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)。

值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結果。每種測定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應考慮：①實(shí)驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時(shí)間。

考馬斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應用。

3.蛋白質(zhì)定量測定的方法有哪些

定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。

凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時(shí)

8~10小時(shí) 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時(shí)太長(cháng)

雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò )合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似

紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；

Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；

各種硫醇 耗費時(shí)間長(cháng)；操作要嚴格計時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；

SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化